Тканевая реакция на трансплантацию аллогенной твердой мозговой оболочки и аллоамниона в эксперименте и ее значение для ринопластики и блефаропластики

Ишмаметьев Илья Игоревич, к.м.н. Ишмаметьев Игорь Леонтьевич,
к.м.н. Самарцева Наталья Николаевна Старостина Виктория Викторовна
Перевозчиков Петр Арсентьевич, к.м.н.

ООО «Пластика», Ижевск

ГУЗ «Республиканская офтальмологическая клиническая больница МЗ УР»

Опубликовано:
Журнал «Анналы пластической, реконструктивной и эстетической хирургии» № 3, c. 17, 2013 год.

Тканевая реакция на трансплантацию аллогенной твердой мозговой оболочки и аллоамниона в эксперименте.pdf

Применение в нашей практике аллотрансплантантов, таких как аллоамнион и аллогенная твердая мозговая оболочка заинтересовало нас в дальнейшем изучении их взаимодействия с тканями реципиента.

Цель работы — оценить тканевую реакцию на трансплантацию аллогенной твердой мозговой оболочки и аллоамниона в эксперименте.

Экспериментальное исследование проведено на 6 лабораторных крысах- самцах беспородной линии, окрас — белый. Масса от 200 до 300 грамм.

В качестве исследуемых биопластических материалов использовали аллоамнион и аллогенную ТМО, консервированных в растворе «биопласт».

В ходе эксперимента выяснилось, что плотная по своей структуре ТМО не резорбировалась у лабораторного животного в течение 2 месяцев, что позволяет предполагать использование её для коррекции контурных деформаций при ринопластике. Более рыхлый по своей структуре аллоамнион резорбировался и замещался рубцовой тканью у лабораторного животного примерно через 2 месяца. Исходя из этого, можно предполагать использовать его для замещения тонких соединительнотканных образований, а именно — для укрепления тарзоорбитальной фасции при блефаропластике, где требуется быстрое замещение аллотрансплантанта соединительнотканным регенератом без изменения эластичности анатомических структур рецепиентной зоны.

Введение

На сегодняшний день в арсенале у хирургов имеются как синтетические имплантаты, так и трансплантанты биологического происхождения.

Несомнено, что аутотрансплантанты не обладают антигенными свойстами и приживаются чаще хорошо, так как нет необходимости преодолевать реакцию тканевой несовместимости. Однако главными недостатками аутотрансплантантов являются ограниченная возможность забора определенных тканей и неоправданная травматичность оперативного вмешательства (например, взятие аутореберного хряща при ринопластике). В свою очередь аллотрансплантанты дают широкую возможность получения тканей без дополнительной травмы для пациента.

По данным многочисленных исследований, морфологические результаты операций по аллотрансплантации тканей отличаются большим разнообразием в связи с тем, что на конечный результат влияет реакция тканевой несовместимости[1]. При пересадке консервированной ткани выраженной имунной реакции не наблюдается. Следовательно, аллотрансплантанты либо замещаются соединительной тканью, либо инкапсулируются.

Наибольшее снижение антигенных свойств дает консервация тканей в растворах альдегидов, но после аллотрансплантации, в большинстве случаев, наблюдается икапсуляция аллотрансплантантов, роль которых сводится к функции биологических протезов [2]. При обработке альдегидами происходит образование дополнительных поперечных межмолекулярных сшивок в коллагеновых волокнах, повышающих устойчивость последних к ферментативному лизису после трансплантации [3].

Многие исследователи пришли к выводу, что антигенные свойства аллотрансплантантов снижаются вследствие разрушения клеточных элементов, как главных иммунногенных компонентов пересаживаемых тканей [4]. Установлено, что аллотрансплантанты подвергаются постепенной резорбции и замещаются новообразованной тканью [5].

В исследованиях аллотрансплантантов с различной плотностью упаковки коллагенновых волокон было доказано, что наблюдаются различия как в скорости рассасывания, так и в характере их замещения [6]. Более плотный материал вызывал меньшую реакцию в ранние сроки. Скорость резорбции и последующего замещения были ниже, чем при имплантации биоматериала с рыхлой упаковкой коллагенновых волокон. Плотность регенерата коррелировала с плотностью имплантированного материала.

Применяя в своей практике аллоамнион при блефаропластике [7] и аллогенную твердую мозговую оболочку при ринопластике[8], мы наблюдали стойкие отдаленные клинические результаты в течение достаточно длительного времени (более 5 лет).

Что происходит с этими аллотрансплантантами в организме пациента? Сохраняются ли они в неизменном виде, инкапсулируясь, или замещаются рубцовой тканью? Насколько будет стабильным результат?

Целью нашей работы была попытка смоделировать и изучить реакцию тканей рецепиентной зоны на трансплантацию аллогенной ТМО и аллоамниона в эксперименте с крысами.

Материалы и методы

Экспериментальное исследование проведено на 6 лабораторных крысах- самцах беспородной линии, окрас — белый. Масса от 200 до 300 граммов. Хирургические операции на животных производили в асептических условиях. В роли анестезирующего препарата применялся — Золетил 0,1 мл внутримышечно. В качестве исследуемых биопластических материалов использовались:

1. Твердая мозговая оболочка толщиной от 0,7 до 1,0 мм была получена в условиях прозектуры, промыта в стерильном изотоническом растворе натрия хлорида, а затем консервирована в 0,2 % спиртовом растворе тимола. Предварительно проводились все необходимые лабораторные исследования для исключения инфекций, учитывались возраст и сопутствующие заболевания умершего. Забор, консервация и хранение осуществлялись структурным подразделением ГУЗ «Республиканской офтальмологической клинической больницы МЗ УР» — отделением «Биопласт», имеющим лицензию на данный вид деятельности.
2. Аллоамнион. Заготовка и консервация амниотической оболочки проводилась в отделении «Биопласт» при ГУЗ «Республиканской офтальмологической клинической больнице МЗ УР», имеющем лицензию на данный вид деятельности по следующей методике. Забор амниотической оболочки осуществлялся в акушерско-гинекологических стационарах подготовленным врачебным персоналом с соблюдением правил асептики в ходе кесарева сечения и родов доношенным плодом. Предварительно проводились все необходимые лабораторные исследования для исключения инфекций, учитывались возраст и сопутствующие заболевания рожениц. В стерильном боксе лаборатории амниотическая оболочка отделялась от пуповины и плаценты, отмывалась в стерильном изотоническом растворе натрия хлорида с антибиотиками широкого спектра действия. В дальнейшем амнион помещался в 0,2% спиртовый раствор тимола при температуре 2-4 C0. Смена раствора осуществлялась трижды через каждые 24 ч, затем раствор менялся каждые 7-10 дней в течение 2 месяцев. Через 2 месяца амниотическая оболочка помещалась в стерильные стеклянные сосуды с 0,2 % спиртовым раствором тимола с обкаткой колпачками, наклеивались этикетки.

Техника операции

После обработки операционного поля на спине лабораторного животного, по средней линии выполняли разрез длинной 1,5-2 см. Далее формировали карман между мышцами и кожей спины в надлопаточной области, куда и помещали исследуемые трансплантаты (рис 1).

Рис. 1 Формирование кармана между мышцами и кожи спины в надлопаточной области лабораторного животного.

Кожу ушивали узловыми швами (полипропилен 3/0). Срок наблюдения составил от 7 до 60 дней. У всех крыс раны заживали первичным натяжением, послеоперационных осложнений связанных с отторжением или смещением аллотрансплантата не наблюдалось.

Из эксперимента животных выводили на 7-й, 30-й и 60-й дни. Забой проводили под наркозом — внутримышечное введение 0,15 мл препарата Золетил. Взятие биоптатов проходило в асептических условиях. Всего — 6 биоптатов. Смещения и миграции аллотрансплантантов не наблюдалось. Биоптаты фиксировали 10 % раствором формалина и по стандартной методике делали срезы, окраска их производилась гематоксилин-эозином.

Результаты

Под микроскопом в препаратах наблюдали следующую морфологическую картину:

1. Биоптат аллоамниона, взятый на 7-й день (рис.2). В зоне трансплантации аллоамниона наблюдается разрастание соединительной ткани, с обильной лимфогистоцитарной инфильтрациией, эпителий врастает в раневой канал с явлениями гиперплазии, под эпителием сохраняется лимфоидная инфильтрация, в дерме — обильная лимфоидная инфильтрация.

   
   Рис. 2 Аллотрансплантант амнион, 7-й день. Видна лимфогистоцитарная инфильтрация (2) вокруг амниона (1), окраска гематоксилин-эозином, х 40.

2. Биоптат ТМО, взятый на 7-й день (рис.3). В зоне трансплантации ТМО наблюдается разрастание активных фибробластов, продукция коллагена, эпителиальный слой восстановлен, но с явлением неравномерной гиперплазии. Вокруг трансплантанта ТМО имеется выраженная лимфогистоцитарная инфильтрация, с образованием клеток инородных тел, увеличением активности фибробластов, образованием соединительнотканной капсулы. Лимфогистоцитарная инфильтрация наблюдается и вокруг раневого канала в большем случае, чем в первом эксперименте.
   
   Рис. 3 Аллотрансплантант ТМО, 7-й день. Видна лимфогистоцитарная инфильтрация (2) вокруг ТМО (1), окраска гематоксилин-эозином, х 40.
3. Биоптат ТМО, взятый на 30-е сутки (рис.4). В зоне трансплантации ТМО виден рубец треугольной формы, покрытый неравномерным эпителием, в субдермальном слое – лоскут ТМО, вокруг которого образовалась соединительнотканная капсула. В тканях окружающих ТМО сохраняется лимфоидная инфильтрация, со стороны окружающих тканей, идет пролиферация фибробластов, образование соединительнотканной капсулы.

   
   Рис.4 Аллотрансплантант ТМО, 30-й день. Образование соединительнотканной капсулы (2) вокруг ТМО (1), окраска гематоксилин-эозином, х 5.

4. Биоптат аллоамниона, взятый на 30-е сутки (рис.5). В зоне трансплантации аллоамниона, на гистологическом материале явного рубца не определяется, в дерме, ближе к мышечному слою остатки амниона, с явлением инкапсулирования, сохраняется лимфоцитарная инфильтрация. В данной проекции ближе к эпителию волокна соединительной ткани более плотные.

   
   Рис. 5 Аллотрансплантант амнион, 30-й день. Явление инкапсулирования, сохраняется лимфоцитарная инфильтрация (2) вокруг аллоамниона (1), окраска гематоксилин-эозином, х 5.

5. Биоптат аллоамниона, взятый на 60-е сутки (рис.6). В зоне трансплантации аллоамниона наблюдается небольшое углубление эпителия, в области дефекта волокна соединительной ткани расположены более плотно, воспалительной инфильтрации нет. Под мышечным слоем наблюдается ткань розоватого цвета, между мышцами и данной тканью формируется прослойка в виде капсулы с остатками лимфоцитарной инфильтрации.

   
   Рис. 6 Аллотрансплантант амнион, 60-й день. Формирование капсулы с остатками лимфоцитарной инфильтрации (2) вокруг аллоамниона (1), окраска гематоксилин-эозином, х 5.

6. Биоптат ТМО, взятый на 60-е сутки (рис.7). В зоне трансплантации ТМО на поверхности эпидермиса наблюдается небольшое уплотнение, покрытое эпителием с явлениями гиперкератоза и паракератоза, в дерме соединительнотканные волокна расположены более компактно, воспалительной инфильтрации нет, вокруг лоскута ТМО — пролиферативная активность фибробластов с образованием соединительнотканной капсулы.

   
   Рис.7 Аллотрансплантант ТМО, 60-й день. Пролиферативная активность фибробластов с образованием соединительнотканной капсулы (2) вокруг ТМО (1), окраска гематоксилин-эозином, х 5.

Обсуждение

Применение трансплантантов в пластической хирургии всегда сопряжено с развитием воспаления и возможного последующего отторжения. Степень выраженности этих явлений напрямую зависит от антигенных свойств трансплантантов и может проявляться как непосредственно, так и через несколько лет после операции. Если же речь идет об аллотрансплантантах, то реакция окружающих тканей видна в раннем послеоперационном периоде.

В результате проведенного исследования отмечено, что на 7-й день в зоне трансплантации аллоамниона и ТМО наблюдалось разрастание соединительной ткани, с обильной лимфогистоцитарной инфильтрацией, а также увеличение активности фибробластов и образование соединительнотканной капсулы. В зоне же трансплантации аллоамниона наблюдаются явления гиперплазии, под эпителием сохраняется лимфоидная инфильтрация, в дерме — обильная лимфоидная инфильтрация. В зоне трансплантации ТМО наблюдается разрастание активных фибробластов, продукция коллагена, эпителиальный слой восстановлен, но с явлением неравномерной гиперплазии.

Такая реакция может свидетельствовать о том, что данные аллотрансплантанты являются инертными по отношению к окружающим тканям и не подвержены резорбции на этом этапе своей эволюции.

После трансплантации на 30-й день под микроскопом обнаружена следующая гистологическая картина: вокруг аллотрансплантантов образовывается сформированная соединительнотканная капсула, а со стороны окружающих тканей наблюдается пролиферация фибробластов, лимфоцитарная инфильтрация сохраняется. Вокруг лоскута ТМО образовывается соединительнотканная капсула, в тканях окружающих ТМО сохраняется лимфоидная инфильтрация. А в зоне трансплантации аллоамниона наблюдаются явления инкапсулирования и сохраняется лимфоцитарная инфильтрация.

На 60-е сутки в зонах трансплантации было отмечено отсутствие воспалительной инфильтрации, наблюдалась пролиферативная активность фибробластов с образованием соединительнотканной капсулы. В зоне трансплантации аллоамниона воспалительной инфильтрации не наблюдается, волокна соединительной ткани расположены более плотно, формируется прослойка в виде капсулы с остатками лимфоцитарной инфильтрации. В дерме над областью трансплантации ТМО соединительнотканные волокна расположены более компактно, вокруг лоскута ТМО образуется соединительнотканная капсула.

Наличие сформированной соединительнотканной капсулы говорит об инертности аллотрансплантантов к окружающим тканям, а отсутствие рассасывания ТМО и сохранение своей первоночальной структуры дает возможность прогнозирования послеоперационного результата.

Скорость резорбции аллоамниона в эксперименте отличалась от таковой у ТМО во временном промежутке, а именно — на 60-е сутки в зоне трансплантации аллоамниона наблюдается ткань розоватого цвета, между мышцами и данной тканью формируется прослойка в виде капсулы с остатками лимфоцитарной инфильтрации, то есть аллоамнион замещается соединительнотканным регенератом через 2 месяца. Тогда как в зоне трансплантации ТМО на 60-е сутки, четко видна структура аллотрансплантанта с образованием соединительнотканной капсулы.

Таким образом, плотная по своей структуре ТМО не резорбировалась на 60-й день, что очень важно для предположения использования её при коррекции контурных деформаций в ринопластике. Более рыхлый по своей структуре аллоамнион можно предполагать использовать для замещения тонких соединительнотканных образований, а именно — для укрепления тарзоорбитальной фасции при блефаропластике, где требуется быстрое замещение аллотрансплантанта соединительнотканным регенератом без изменения эластичности анатомических структур рецепиентной зоны.

Выводы

1. На всех этапах наблюдения не обнаружены явления дистрофии окружающих тканей (вакуолизация, отек и т.д.). Это напоминает реакцию реципиентных тканей на аутотрансплантант.
2. Эксперимент показал резорбцию аллоамниона: тонкий и рыхлый аллоамнион замещается соединительнотканным регенератом у лабораторного животного через 2 месяца.
3. В зоне трансплантации ТМО на 60 сутки четко видна структура аллотрансплантанта с образованием соединительнотканной капсулы.
4. Скорость резорбции зависит от структуры — плотности трансплантанта: плотная по своей структуре ТМО не резорбировалась, а более рыхлый по своей структуре аллоамнион замещался соединительнотканным регенератом через 2 месяца.
5. Учитывая скорость резорбции, можно рекомендовать различные аллотрансплантанты для различных целей. Например — для контурно-объемной пластики предпочтительна ТМО (долго или вообще не рассасывается), для замещения тонких соединительнотканных структур (укрепление тарзоорбитальной фасции при блефаропластике) лучше предположить применение алоамниона.
6. Наличие сформированой соединительнотканной капсулы вокруг ТМО и аллоамниона говорит об инертности аллотрансплантантов к окружающим тканям, а отсутствие резорбции ТМО и сохранение своей первоначальной структуры дает возможность прогнозирования послеоперационного результата.

Литература

1. Муслимов, С.А. Морфологические аспекты регенеративной хирургии/С.А.Муслимов.- Уфа:Башкортостан, 2000. – 168 с.
2. Schmidt, T. Tarsusplastik mit hondroplast / T. Schmidt, K.P. Leipert, C. Fellboum // Fortschr Ophthalmol. 1991. - Vol.88. - №5. - P.279-282.
3. Jorge-Herrero, E. Influence of different chemical cross-linking treatments on the properties of bovine pericardium and collagen/ E. Jorge-HerreroP.Fernandez , J.Turnay ,N. Olmo ,P. Calero ,R. Garcia ,I. Freile , J.L. Castillo Olivares // Biomaterials. — 1999. — Vol. 20, № 6. — P. 539-545.
4. Bujia , J. Comparative study of the effect of different chemical procedures on the antigenicity of allogenic transplants of the human trachea/ J,Bujia , E,Wilmes E, J,Bartual-Pastor , C,Hammer // Acta Otorrinolaringo. Esp. — 1993. — Vol. 44, № 3. — P. 209-216.
5. Longmire ,W. R. et al. General Surgical Problems of Tissue Transplantacion / W.R.,Longmire [ et al.] // Preservation and Transplantacion of Normal Tissues: ACIBA Foundation Symposium. — London. —1954. — P. 23–43.
6. Нигматуллин, Р. Т. Морфологические аспекты пересадки соединительнотканных аллотрансплантатов: Автореф. дис. … д-ра мед. наук/ Р. Т. Нигматуллин — Новосибирск, 1996. — 40 с.
7. Ишмаметьев, И.Л. Опыт использования аллоамниона в эстетической блефаропластике/ И.Л.Ишмаметьев, И.И.Ишмаметьев, В.В.Старостина, В.В.Жаров, П.А.Перевозчиков, Е.Р.Точилова//Анналы пласт. реконстр. эстет. Хирургии – 2009. - №3. – С.33 – 37.
8. Ишмаметьев, И.Л. Применение аутотрансплантата из твердой мозговой оболочки для хирургического устранения и профилактики неровностей спинки носа/ И.Л.Ишмаметьев, И.И.Ишмаметьев, В.В.Старостина, В.В.Жаров, П.А.Перевозчиков, Е.Р.Точилова//Анналы пласт. реконстр. эстет. Хирургии – 2010. - №1. – С.23 – 33.