Биологические эффекты инъекций нанодисперсной плаценты человека, лежащие в основе эндогенноиндуцированной ревитализации

П.А. Перевозчиков, И.И. Ишмаметьев, И.Л. Ишмаметьев,
Ю.Л. Васильев, д-р физ.-мат. наук О.В. КАРБАНЬ, B.C. САМАРЦЕВ

Кафедра офтальмологии ГОУВПО «ИГМА»
Минздравсоцразвития России
000 «Пластика»
Кафедра гистологии, эмбриологии и цитологии ГОУВПО «ИГМА»
Минздравсоцразвития России
Отдел структурно-фазовых превращений ФГБУ науки
Физико-технического института УрО РАН

Опубликовано:
Журнал «Анналы пластической, реконструктивной и эстетической хирургии» №1, с. 79, 2013 г.

Биологические эффекты инъекций нанодисперсной плаценты человека, лежащие в основе эндогенноиндуцированной ревитализации.pdf

Показано, что при применении разработанного авторами порошка нанодисперсной плаценты в дозе 5 мг сухого вещества в зоне оперативного вмешательства модулируются эндогенные механизмы ревитализации, проявляющиеся в значительном усилении пролиферативных и регенераторных процессов в соединительной ткани глаза крысы с усилением коллагенообразования и ангиогенеза. Это подтверждено наличием большого количества функционирующих кровеносных капилляров, прорастающих превазоидов, а также эндотелиальных почек роста и значительным повышением функциональной активности фибробластов, что говорит о высокой биологической активности наноразмерной формы плаценты человека, несмотря на применение ее малых доз.

Ключевые слова: репаративная регенерация, моду¬ляция ревитализации, нанодисперсная плацента.

Введение

Изучение проблем воспаления и репаративной регенерации, а также модуляция процессов регенерации поврежденных тканей является важной проблемой биологии и медицины. Срыв гомеостаза в виде нарушений механизмов ауторегуляции (межклеточные и межтканевые взаимодействия, гуморального, иммунного, нейротрофического) ведет к нарушению и извращению стереотипной динамики процесса. В результате этого воспаление с последующими дегенеративно-дистрофическими изменениями в тканях часто приводит к хронизации патологического процесса или формированию грубоволокнистого (рубцового) регенерата, являющегося причиной нарушения функций ткани и органа [1]. Поэтому очевидна необходимость коррекции нарушенных функций клеток, тканей, органов и систем органов путем восстановления регуляторных систем организма, что сегодня является одним из важнейших направлений фармакотерапии. В связи с этим выделяется перспективный и безопасный способ лечения ряда заболеваний — биологическая терапия, или органотерапия с применением в лечебных целях органопрепаратов, произведенных из источников сырья животного происхождения или биологического материала человека [2].

В качестве биологического материала в клинической практике широко применяется плацента человека [3] и ее производные: экстракт плаценты [4] или ее гидролизат [5, 6]. Интерес к плаценте не ослабевает и в настоящее время, т. к. она содержит различные факторы роста (инсулиноподобный, гепатоцитов, фибробластов, эпидермальный и др.), цитокины (интерлейкины, интерферон), низкомолекулярные пептиды, нуклеиновые и аминокислоты, гликозаминогликаны (гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфат), различные витамины, микроэлементы, гормоны и т. п., участвующие в регуляции гомеостаза, выполнении метаболической, репаративной и защитной функций [2].

Однако применение данных форм плаценты человека несет непродолжительный биологический эффект, что связано с усваиванием или разрушением введенных в организм производных плаценты. Поиск новых форм плаценты, способных вызывать продолжительные биологические эффекты за счет активирования эндогенных механизмов регенерации, по нашему мнению, остается актуальным. Создание биологических материалов, способных глубоко проникать, вызывать репарацию и васкуляризацию в строме подлежащих тканей, тем самым восстанавливать их трофику и функцию, может значительно расширить возможности медицины в комплексном лечении заболеваний и особенно таких, которые до сих пор трудно поддаются или совсем не поддаются лечению.

Одним из методов увеличения биодоступности и биологической активности, сочетающейся с низкими антигенными свойствами и высоким энергетическим потенциалом, является повышение дисперсности материалов с применением механоактивации [7]. Однако до сих пор никто не занимался получением механоактивированных нанодисперсных биологических материалов. Нами разработан способ получения биологического материала в виде нанодисперсного порошка [8].

Целью данной работы является изучение биологических эффектов взаимодействия соединительной ткани с нанодисперсным материалом плаценты человека при его введении в соединительнотканные структуры органа зрения в условиях эксперимента.

При этом орган зрения был взят за основу модели тканевой и клеточной организации целого организма, а исследование биологических свойств тканей зоны имплантации и ее гистологический анализ позволял раскрыть реактивные и структурно-функциональные изменения всего организма.

Материалы и методы

Плацента человека, полученная в ходе кесарева сечения и родов доношенным плодом, отделенная от пуповины и амниотической оболочки, промытая в стерильном изотоническом растворе натрия хлорида, была высушена методом лиофильной сушки, а затем механически мелко измельчена.

Механоактивированный порошок получали методом механического измельчения крупнодисперсного лиофилизированного материала в шаровой планетарной мельнице «Pulverisette-7». Порошок нанодисперсной плаценты человека состоял [9] из отдельных частиц размером от 200 до 500 нм, сформированных зернами размером от 40 до 100 нм. Частицы в свою очередь образовывали слабосвязанные агломераты размером от 2 до 10 мкм (рис. 1).

При этом порошок нанодисперсной плаценты в отличие от крупноизмельченного порошка (размеры более 45 мкм) обладал повышенной гидрофильностью и хорошей смачиваемостью. Получали взвесь путем разведения порошка нанодисперсной плаценты

Рис. 1 Агломерат частиц нанодисперсной плаценты человека (атомно-силовая микроскопия (АСМ) (а) и era схематичное изображение (б).

человека в 0,08 мл физиологического раствора. Взвесь крупноизмельченной плаценты для введения инъек¬ционным путем приготовить не удалось из-за плохой смачиваемости вещества, а также из-за отсутствия проходимости через инъекционную иглу.

Структурно-фазовый анализ порошков исходной крупнодисперсной и механоактивированной плаценты проводился методом рентгеновской дифракции (РД) на дифрактометре ДРОН-3 в монохроматизированном Си Ка-излучении

Контроль плаценты до и после механоактивации проводили методом Фурье-ИК-спектроскопии на спектрометре «Excalibur 3100» фирмы «Varian».

Исследования были выполнены на самцах белых беспородных крыс в возрасте 6 месяцев, массой тела от 200 до 250 г. В ходе эксперимента животным произведено введение взвеси лиофилизированной механоактивированной нанодисперсной плаценты под конъюнктиву на склеру глаза под общей анестезией. В роли анестезирующего препарата применялся золетил 0,1 мл (внутримышечно). Ведение взвеси производилось в верхненаружном квадранте глазного яблока под конъюнктиву с помощью иглы диаметром 0,4 мм. В первой группе (опыт) применяли взвесь из расчета 5 мг сухого вещества. Во второй опытной группе произведено введение взвеси нанодисперсной плаценты из расчета 25 мг сухого вещества. Третья группа животных (контроль) состояла из ложнооперированных крыс, которым под анестезией вводили под конъюнктиву физиологический раствор. Оперативное пособие завершалось инстилляцией 0,25 % левомицетина с целью профилактики гнойно-септического воспаления. Экспериментальные исследования проведены с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Забой проводили под наркозом — внутримышечное введение 0,15 мл препарата золетил. Изучены группы животных к концу 3-, 7-, 14-х сут, 1 мес после манипуляций. Фиксацию осуществляли в 10 % растворе нейтрального формалина, заливали в парафин. Исследование структуры поверхности гистологических срезов зоны оперативного вмешательства проводили на сканирующей зондовой лаборатории Ntegra (NT-MDT) в полуконтакном режиме на воздухе после предварительной химической очистки от парафина. Для общего морфологического анализа препараты окрашивали гематоксилин-эозином.

Результаты и обсуждения

Как в исходном, так и после механоактивации аллоплацента находится в рентгеноаморфном состоянии (рис. 2). Отсутствие структурных рефлексов a-Fe свидетельствует о том, что при механическом измельчении в пределах чувствительности метода рентгеновской дифракции не произошло загрязнения образцов материалом используемых измельчающих тел.

Рис. 2 Рентгеновские дифрактограммы аллоплаценты до (а) и после механоактивации (б)

ИК-спектры исходной и механоактивированной плаценты (рис. 3) практически идентичны, за исключением небольшого перераспределения интенсивностей полосы в области больших волновых чисел. Повышение интенсивности сигнала на спектре механоактивированного образца в области волновых чисел от 2400 до порядка 3000 см^-1 свидетельствует о том, что в результате механоактивации происходит разрушение внутримолекулярных водородных связей молекулы белка и образование межмолекулярных водородных связей. Поскольку мы имеем дело с чрезвычайно сложным органическим объектом, который содержит большое количество всевозможных органических структур и связей, об остальных изменениях без допол¬нительных исследований (масс-спектрометрии, ЭПР, ЯМР-исследований и т.д.) по результатам одной только ИК-спектроскопии говорить трудно. Можно отметить, что спектры по виду походят на отдельные белковые структуры, а также соединения с гетерогенной циклической связью.

В целом из приведенных выше результатов иссле¬дований следует, что механическое измельчение не

Рис. 3 ИК-спектры исходного порошка плаценты и порошка плаценты человека после механоактивации.

Рис. 4 Морфологическая картина зоны операции на 3-е сут в контрольной группе (а) и в первой опытной группе после введения 5 мг нанодисперсной плаценты (б). Окраска гематоксилин-эозином, х400 А — многослойный плоский неороговевающий эпителий конъюнктивы; Б- соединительнотканевая основа конъюнктивы; В- зоны скопления клеток лейкоцитарного ряда; Г — расширение микрососудов

загрязняет измельчаемую плаценту, в ней не происходит каких-либо существенных механоиндуцированных химических превращений и соответственно изменения ее химического состава. На 3-и сут после имплантации в контрольной группе животных местные изменения проявлялись в виде умеренного асептического воспаления (рис. 4 а). В первой опытной группе лейкоцитарные реакции в окружающей конъюнктиве и субконъюнктивальной основе были более выражены по сравнению с контролем. В зоне введения нанодисперсной плаценты преобладали клетки лимфоцитарного ряда, выявлялись единичные нейтрофильные и эозинофильные гранулоциты. Наблюдалось умеренное расширение микрососудов (рис. 4 б). При исследовании АСМ в прилежащих месту введения нанодисперсной плаценты выявлены признаки умеренного разрыхления пластинок коллагеновых волокон, обусловленных отеком аморфного компартмента межклеточного вещества (рис. 5). Коллагеновые волокна сохраняют D-исчерченность и компактное расположение в пределах пластинок. В лонгитудинальном направлении в коллагеновых волокнах сохраняется равномерный диаметр, что указывает на отсутствие в них признаков деструктивных изменений. На микросканограмме кроме описанных коллагеновых пластинок имеется участок с зернами введенной нанодисперсной плаценты, представленными частицами 0,2-0,3 мкм.

Рис. 5 Коллагеновые волокна соединительной ткани с глобулами нанодисперсной плаценты в зоне введения в первой опытной группе (АСМ) А — коллагеновые волокна с нормальной D-исчерченностью и компактным расположением; Б- зерна введенной нанодисперсной плаценты, представленной частицами 0,2-0,3 мкм

Во второй опытной группе на 3-е сут у всех исследованных животных проявления воспалительного ответа были выражены и носили очаговый характер, при этом инфильтрация клеточными элементами носила

Рис. 6 Морфологическая картина зоны введения 25 мг. нанодисперсной плаценты на 3-е сут во второй опытной группе. Окраска гемотоксилин-эозином, х400.
А — скопление клеток нейтрофильного ряда в соединительнотканной основе конъюктивы.

выраженный характер и проявлялась в преобладании нейтрофильно-клеточных ответов (рис. 6). Существенно увеличивалась толщина конъюнктивы, в первую очередь за счет признаков экссудации. Возникали проявления умеренного отека межклеточного вещества с конъюнктивы и поверхностных участков склеры, с разволокнением коллагеновых пластинок последней. Расширение микрососудов не сопровождалось морфологическими признаками стаза. На АСМ выявлено изменение структуры коллагена в виде потери либо резкого уменьшения проявлений поперечно-полосатой исчерченности (рис. 7). Волокна разрыхлены, между ними выявляется резкое увеличение объема аморфного матрикса. Пластинки теряют упорядочное распределение, отдельные волокна формируют зоны утолщений, по-видимому, на фоне повышенной гидрофильности. Все это указывает на деструктивные процессы в межклеточном веществе склеры, прилежащие к месту ведения нанодисперсной плаценты. Наряду с формированием глобул вводимый материал формирует рыхлый агломерат.

К концу 7-х сут начинались процессы ранней реэпителизации раневой зоны, что имело место как у контрольных, так и во всех группах опытных животных. В контроле в зоне раневого дефекта были видны единичные мононуклеары. Явления периваскулярного отека незначительны. В первой опытной группе отмечались инфильтративно-экссудативные процессы в виде лимфоцитарно-моноцитарных клеточных ответов

Рис. 7 Коллагеновые волокна соединительной ткани с агломератом нанодисперсной плаценты в зоне введения в третьей опытной группе (АСМ)
А — набухшие коллагеновые волокна с уменьшением проявлений поперечно-полосатой исчерченности; Б — рыхлый агломерат, представленный склеенными зернами нанодиспесной плаценты.

умеренной инфильтрации мононуклеарами в участках тканей конъюнктивы и поверхностных слоях склеры в зоне введения взвеси. Выявлялось умеренное расши¬рение сосудов микроциркуляторного русла. Помимо этого были отмечены пролиферативно-фибробластические ответы в виде клеточных тяжей из фибробластов, разделенных нежными волокнистыми структурами. У животных второй опытной группы проявления асептических экссудативно-клеточных реакций были более выраженными. Это проявлялось в значительном числе клеток лейкоцитарного ряда в зоне введения взвеси с преобладанием моноцитарно-макрофагических и нейтрофильно-клеточных ответов

К концу 14-х сут после инъекции у контрольных животных в участках конъюнктивы наблюдались признаки реэпителизации. У животных первой опытной группы зоны посттравматического дефекта также подверглись реэпителизации. В зоне введения взвеси выявлены признаки умеренной инфильтрации мононуклеарами и немногочисленными полиморфно-ядерными клетками без явлений набухания клеток и отека межклеточного вещества. Дополнительно обнаруживалось значительное число клеток фибробластического ряда с наличием фигур митозов. Отмечалось увеличение числа функционирующих кровеносных микрососудов, появление эндотелиально-клеточных тяжей и эндотелиальных почек роста, что указывало на активацию репаративного ангиогенеза.

Рис. 8 Морфологическая картина зоны операции через 1 мес в контрольной группе. Полная реэпителизация раневого дефекта. Окраска гематоксилин-эозином, х200
А — многослойный плоский неороговевающий эпителий коръюктивы; Б — соединительнотканевая основа конъюктивы.

Морфологическая картина через 1 мес в зоне введения 5 мг нанодисперсной плаценты в первой опытной группе. Окраска гематоксилин-эозином, х200
А — вновь сформированные сосуды; Б — активные фибробласты

в рассматриваемый срок. В поверхностных участках склеры, в зоне введения взвеси наноплаценты формировались обильные сети нежных коллагеновых волокон, указывающих на активный коллагеногенез. У животных второй опытной группы сохранялись проявления

Рис. 10 Морфологическая картина через 1 мес в зоне введения 25 мг нанодисперсной плаценты во второй опытной группе. Окраска гематоксилин-эозином, х200
А — вновь сформированные коллагеновые волокна

локальных асептических экссудативно-пролиферативных реакций. Имелось множество клеток моноцитарно-макрофагического и фибробластического рядов. В поверхностных участках склеры наблюдались признаки отека с увеличением объема аморфного компонента межклеточного вещества и разобщением пластинок коллагеновых волокон. Выявляются отдельные плазмоциты и лимфоциты. Нередко обнаруживались фигуры митозов. Отмечались гипертрофированные фибробласты, косвенно указывающие на значительное повышение их функциональной активности, что подтверждалось усилением коллагенообразования, значимо превышающем аналогичные явления в контрольной и первой опытной группах. Имелось много как функционирующих кровеносных капилляров, так и прорастающих превазоидов и эндотелиальных почек роста.

К концу 1 -го мес в контрольной группе зона операции ничем не отличалась от интактной конъюнктивы (рис. 8). В первой опытной группе по сравнению с контролем толщина фиброзной оболочки была увеличена за счет новообразованных коллагеновых волокон с множеством вновь сформированных сосудов, активных фибро- бластов (рис. 9). Новообразованная соединительная ткань по плотности приближалась к отдаленной от зоны имплантации. Макромолекулярная организация вновь образованных коллагеновых волокон указывала на высокую степень их морфологической зрелости. Волокнистая организация межклеточного вещества склеры приобретала упорядоченный характер. Во второй группе по сравнению с первой процесс коллагенообразования имел более диффузный и выраженный характер (рис. 10).

Выводы

Таким образом, взвесь нанодисперсной плаценты оказывает выраженное модулирующее действие в зоне ее введения в ранние сроки после оперативного вмешательства. При этом морфологические изменения носят преимущественно очаговый характер, в последующем приобретая диффузный, заключающийся в значительном усилении пролиферативных и регенераторных процессов в соединительной ткани с усилением коллагенообразования и ангиогенеза. Применение малых доз нанодисперсной плаценты (5 мг) модулирует реггаративные процессы соединительной ткани, запуская эндогененные механизмы ревитализации. Использование относительно больших доз нанодисперсной плаценты (25 мг) у крыс чрезмерно усиливает проявление репаративных и асептических воспалительных процессов в зоне введения, что может даже носить негативный характер.

Литература

1. Мусина, Л.А. Функциональная морфология макрофагов при регенерации тканей, индуцированной аллогенными биоматериалами : дис. … д-ра биол. наук / Мусина Л.А. — Уфа, 2007. — 269 с.
2. Гладских, Л.В. Новые подходы биомедицины к коррекции адаптационных механизмов оздоровления и омоложения / Л.В. Гладских // Пластическая хирургия и косметология. — 2011.-№ 2.-С. 321-325.
3. Ролик, И.С. Фетальные органопрепараты. Клиническое применение / И.С. Ролик. — М. : РегБиоМед, 2003. — 736 с.
4. Chandanwale, A. Comparative evaluation of human placental extract for its healing potential in surgical wounds after orthopaedic surgery: an open, randomised, comparative study / A. Chandanwale //J. Indian Med. Assoc. — 2008. — Vol. 106(6). — P. 405-408.
5. Элементарный состав препарата Лаеннек и его ключевая роль в фармакологическом воздействии препарата / О.А. Громова [и др.] // Пластическая хирургия и косметоло¬гия.-2010.-№ 4.-С. 1-7.
6. Ярилин, А.А. Гуморальная иммунорегуляторная сеть кожи (к обоснованию применения препарата Лаеннек) / А.А. Ярилин // Иннъекционные методы в косметологии. — 2010. — № 4. — С. 30-36.
7. Механохимия создания новых материалов : учеб. пособие / О.В. Андрюшкова [и др.]. — Новосибирск, 2007. — 385 с.
8. Способ приготовления биофункционального трансплантата в виде наночастиц : пат. РФ № 2367448 от 09.01.08.
9. Сканирующая зондовая микроскопия в изучении регенерации тканей при склеропластических операциях в офтальмологии / В.В. Жаров [и др.] // Поверхность Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. — 2009. — № 10. — С. 69-74.